[생명과학 실험] 대장균군 감별 시험법(IMViC test)

 대장균군 감별 시험법(IMViC test)를 수행하고, 장내에 존재하는 여러 미생물의 종류와 특성을 탐구해 보세요. 추가적으로, 미생물로 인해 발생하는 여러 질병을 탐구해 보세요.

 

대장균군 감별 시험법(IMViC test)

 

▶ 미생물 IMViC test 검사란?

Escherichia coli 등의 장내 세균을 탐색하는 데 쓰이는 일련의 검정법으로 Indole 생산 시험, Methyl red 반응, Voges-Proskauer 반응, Citrate 이용성​의 4가지 시험을 함께 검정하는 시험법이다. I는 Indole 생성능 검사, M은 methyl red 검사, V는 voges-Proskauer 검사, C는 Citrate 이용검사를 나타내는 것이며 I는 단지 발음을 간편하게 하기 위해 쓰여진 것이다.

 

미생물 IMViC test 검사

 

(1) Indole 생성능 실험

① 세균이 tryptophan을 분해효소인 tryptophanase를 생산하는가 여부를 알아보는 반응이다.

② SIM 배지, MIO 배지, LIM 배지 등이 쓰이는데 이들 배지는 tryptophan이 풍부하게 함유된 Peptone을 함유하고 있다. 균을 배양한 한 후 Kovac`s 시약을 첨가하여 적색을 띠면 양성이다. 이 반응은 배지 중에 당이 함유 되어있으면 저해를 받는다.

 

(2) Methyl red 실험

① 세균은 배지내에 존재하는 glucose를 혼합발효 경로를 통해 lactic acid, formic acid, acetic acid와 같은 강한 유기산을 생성한다.

② 세균에 따라서 생성되는 유기산의 종류와 양이 다른데 배양액에 생성된 강한 유기산이 많이 축적되면 배양액의 pH가 내려간다. 지시약인 Methyl red를 배양액에 처리하면 배양액의 pH가 4.4 이하로 되었을 경우 Methyl red의 색깔이 적색으로 변화하므로 세균이 glucose를 이용하여 강한 유기산을 생성하는지를 알 수 있다.

 

(3) Voges-Proskauer 실험

① Voges-Proskauer 검사는 세균이 배지내에 존재하는 glucose를 발효하여 생성한 유기산으로부터 acetylmethylcarbinol (acetoin)과 같은 비산성이나 중성산물을 생성하는지를 판별하는 것이다.

② Klebsiella-Enterobacter-Serratia 그룹에 속하는 세균은 glucose로부터 생성된 acetic acid를 acetoin로 분해한다.

③ 세균의 배양액에서 생성된 acetoin을 관찰하기 위해서는 acetoin을 diethyl 화합물로 산화시켜야 하는데 이러한 반응은 alpha-naphthol 촉매로 하여 강알칼리하에서 산화되면 diacetyl이 전환되는 것이다. 그리고 diethyl은 MR-VP 배지성분인 peptone에 존재하는 guanidine group과 복합반응을 일으켜 적색의 화합물로 변환된다. 이로써 배양액에 세균의 대사산물로 acetoin이 존재하는 가를 알 수 있다.

 

(4) Citrate 이용능 실험

① 발효성 당인 gulcose나 lactose가 배지내에 없을 때 어떤 세균은 citrate를 탄소원으로 이용한다. 배지내에 유일 탄소원으로 존재하는 citrate는 citrate permeaes에 의해 세균의 세포 안으로 운반되고 이는 citrase에 의해 oxaloacetic acid와 acetic acid로 분해된 후 대사됨으로써 최종적으로는 pyruvis acid와 이산화탄소로 된다. 또한 배지의 질소원인 암모늄 염으로부터 암모이나아가 생성되어, citrate가 이용되면 최종산물인 이산화탄소가 전환된 알칼리성 산물인 로와 함께 작용하여 배지의 pH를 알칼리로 변화시킨다.

② 이로써 배지에 존재하는 지시액인 bromothymol blue의 색깔이 녹색에서 청색으로 변화된다.

③ 그러므로 세균이 검사용 배지에서 성장하고 배지의 색깔을 청색화 시키면 양성이며 자라지 못하거나 청색화 시키지 못하면 음성으로 판별된다.

 

▶ 준비물

1) 미생물 : Escherichia coli, Enterobacter aerogenes (여건에 따라 변경가능)

2) 배지와 시약 : SIM（Sulfide indol motility medium), Tryptone, NaCl, para-Dimethyl benzaldehyde, Amyl 또는 isoamyl alchol, Concentrated HCI, 증류수, MR-VP 배지, Methyl red 용액, Barritt's 시약, Simmons'citrate 사면배지

3) 사용기기 : 시험관, 백금이, 알코올램프, 자석막대, 배양기, 진탕배양기, 가압습식멸균기, 가열교반기

 

▶ 실험 과정

1) Indole 생성능 실험

① SIM 한천배지를 녹여 시험관에 분주한 후 가압습식 멸균한다.

② 멸균된 시험관을 수직으로 세워 굳혀 반고층배지를 제조한다.

③ 중앙 부위에 검사하고자 하는 균을 백금선으로 천자접종하여 37°C에서 하룻밤 배양한다.

④ 배양 배지 위에 조심스럽게 Kovac 시약을 0.2~0.5ml (8~10방울) 첨가하여 가볍게 흔들어 색을 관찰한다.

⑤ 배지표면 위층의 시약부분의 색깔이 붉은색으로 변화하면 양성이고, 무색 또는 황색으로 변하면 음성으로 판정한다.

⑥ 또한 Kovac 시약의 염색 전에 균이 성장한 배지부위가 흑색으로 변하면 미생물이 를 생산하는 것이다.

 

2) Methyl red 실험

① MR-VP 액체배지를 제조하여 시험관에 5ml씩 분주한 후 가압습식 멸균한다.

② 검사하고자 하는 균을 배지에 접종하고 37°C에서 24-48시간 진탕배양한다.

③ 배양이 끝난 후 배양액에 methyl red시약을 0.2~0.5ml 첨가하고 가볍게 흔든 후 배양액의 색깔 변화를 관찰한다.

④ 적색으로 변화되는데 이를 양성으로 판정하고 황색을 띄는 경우는 음성이다.

⑤ methyl red는 pH 4.4~6.5 사이에서는 pH에 따라 색깔이 달라지게 되므로 판정하는데 어려움이 있다.

 

3) Voges-Proskauer 반응

① MR-VP 액체배지를 제조하여 시험관에 5ml씩 분주한 후 가압습식 멸균헌더.

② 검사하고자 하는 균을 배지에 접종하고 37°C에서 24-48시간 배양 후 진탕배양한다.

③ 배양이 끝난 후 배양액 0.5ml 5% -naphthol 용액을 0.3ml 40% KOH용액 0.1ml을 각각 첨가 한 후 가볍게 흔들고

④ 실온에 10~15분간 방치하면서 배양액의 색깔의 변화를 관찰한다.　(적색이 되면 양성인데 방치된 시간이 1시간 이상이 되면 양성이 아니라도 적색을 나타낼 수 있으므로 이에 유의해야 한다.)

 

4) Citrate 이용능 실험

① Simmon's citrate 한천배지를 완전히 녹인 후 시험관에 적당량 (5~10ml) 분주하여 가압습식 멸균한다.

② 멸균된 배지를 이용하여 사면배지를 제조한다.

③ 시험균을 사면배지에 획선도말 한 후 35°C에서 24-48시간 배양하여 배지의 색깔 변화를 관찰한다.

④ 청색으로 변화하면 양성이며 녹색으로 그대로 존재하면 음성이다. 그러나 배지의 일부의 색이 변화한 경우 판정에 유의해야 하는데, 사면배지의 윗부분의 색깔이 청색으로 변화한 경우는 citrate의 이용능이 약하여 배지가 얇은 부분이 먼저 변화한 것으로 양성으로 판정할 수 있다.

실험결과

▶ 실험 결과

다음 링크 참고 → https://blog.naver.com/mbcell/222534846407

[대장균군 감별시험법] IMViC test